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《精编分子生物学实验指南（第五版）》是知名度很高、不断更新的《**分子生物学实验方法汇编》（Current Protocols in Molecular Biology）系列的精编版本。新版对原有内容进行了修订和更新，包括：大肠杆菌、质粒和噬菌体，DNA的制备和分析，DNA和RNA的酶学操作，RNA的制备和分析，重组DNA文库的构建，重组DNA文库的筛选，DNA序列测定，克隆化DNA的诱变，DNA导人哺乳动物细胞，蛋白质分析，免疫学，DNA蛋白质相互作用，酿酒酵母，原位杂交和免疫组织化学，聚合酶链反应，蛋白质的表达，蛋白质磷酸化的分析，生物信息学，蛋白质相互作用的分析等；又新增了染色质的装配与分析，核酸阵列，组合文库的建立和使用，单个细胞或一群细胞间差异表达基因的发现和分析四章内容。

目录

译者序

前言

第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体 1

1.1 培养基的制备及细菌学工具 2

1.1.1 极限培养基 2

1.1.2 丰富培养基 2

1.1.3 固体培养基 3

1.1.4 实验工具 5

1.2 在液体培养基中培养

1.2.1 基本方案1 过夜培养 5

1.2.2 基本方案2 大体积培养 6

1.2.3 基本方案3 利用计数极监测生长情况 6

1.2.4 基本方案4 利用分光光度计监测生长情况 6

1.3 固体培养基上培养 7

1.3.1 基本方案l 通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落 7

1.3.2 基本方案2 通过平板划线法分离单菌落 7

1.3.3 基本方案3 通过铺平板分离单个菌落 7

1.3.4 基本方案4 影印平板 7

1.3.5 辅助方案菌株的保存和复苏 8

1.4 经典细菌遗传学选论 8

1.5 质粒载体 13

质粒载体的选择 13

1.6 质粒DNA 的小量制备 20

1.6.1 基本方案1 碱裂解小量制备 20

1.6.2 备选方案 96孔微量滴定板碱裂解法

1.6.3 基本方案2 煮沸小量制备法 22

1.7 质粒DNA 的大量制备 22

1.7.1 基本方案1 碱裂解法制备粗制裂解物 22

1.7.2 基本方案2 氯化铯/溴化乙锭平衡离心法 24

1.7.3 备择方案利用阴离子交换层析或分子筛层析纯化质粒DNA 25

1.8 将质粒DNA 导人细菌细胞

1.8.1 基本方案1 CaC12 转化法

1.8.2 备择方案一步法制备和转化感受态细菌 27

1.8.3 基本方案2 高放率的电转化方法 27

1.9 噬菌体概述 29

1.9.1 裂解性生长 29

1.9.2 溶源性生长 30

1.10 作为克隆载体的噬菌体 32

1.10.1 用噬菌体的优点 32

1.10.2 选择插入的DNA 32

1.10.3 噬菌体来源的克隆载体的图谱 35

1.11 噬菌体铺平板产生噬斑 35

1.11.1 基本方案1 通过连续稀释法分离单个噬斑 35

1.11.2 基本方案2 噬菌体转染和体外包装构建 36

1.12 培养A 衍生的噬菌体载体 37

1.12.1 基本方案通过平板裂解制备噬菌体库 37

1.12.2 备择方案制备液体裂解物 38

1.13 从噬菌体裂解液中制备DNA 38

基本方案 通过分级平衡梯度离心制备DNA 38

1.14 源于丝状噬菌体的载体 40

1.15 利用M13 噬菌体衍生载体制备单链DNA 43

基本方案 利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA 43

第2章 DNA 的制备和分析 45

电泳及其应用 45

凝股和电路 46

2.1 水溶液中DNA 的纯化和浓缩 46

2.1.1 基本方案DNA 的盼抽提和乙薛沉淀 47

2.1.2 备择方案1 异丙醇沉淀DNA 47

2.1.3 辅助方案1 丁醇浓缩DNA 48

2.1.4 辅助方案2 酷抽提法去除残存醋、氯仿或丁醇 48

2.1.5 备择方案2 硅膜离心柱法纯化DNA 49

2.1.6 备择方案3 RNA 及DNA 稀榕液的纯化和浓缩 49

2.1.7 备择方案4 乙酶沉淀法去除低分子质量的寡核背酸和核苷三磷酸 50

2.2 阴离子交换色谱法纯化DNA 50

基本方案 50

2.3 从哺乳动物组织中制备基因组DNA 52

基本方案 52

2.4 从植物组织中制备基因组DNA 53

2.4.1 基本方案氧化铠离心法制备植物DNA 53

2.4.2 备择方案CTAB 制备植物DNA 54

2.5 从细菌中制备基因组DNA

2.5.1 基本方案细菌基因组DNA 的小量制备

2.5.2 备择方案氧化铠法大规模制备细菌基因组DNA 56

2.5.3 辅助方案从脚寻到的DNA 制备物中除去多糖 57

2.6 琼脂糖凝胶电泳 57

2.6.1 基本方案DNA 片段在标准琼脂糖凝股上的分离 57

2.6.2 辅助方案微型凝肢及中型凝肢 58

2.7 脉冲场凝肢电泳 59

2.7.1 基本方案倒转电场凝肢电泳 59

2.7.2 备择方案钳位均匀电场电掠（CHEF电泳） 60

2.7.3 辅助方案高分子质量DNA 样品和分子质量标准物的制备 61

2.8 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA 限制酶切片段 62

2.8.1 基本方案1 琼脂糖凝肢电挽脱 62

2.8.2 基本方案2 NA-45纸电泳 63

2.8.3 基本方案3 低熔点琼脂糖凝肢分离DNA 64

2.8.4 备择方案1 琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝腔中回收DNA 65

2.8.5 备择方案2 硅膜离心桂从低熔点琼脂糖凝腔中回收DNA 65

2.8.6 辅助方案澳化乙键斑点定量法对DNA 浓度进行快速估测 66

2.9 常规凝胶电泳分离小分子DNA 片段 67

2.9.1 基本方案l 非变性聚丙烯酷腔凝肢电旅 67

2.9.2 备择方案聚丙烯酷腊凝肢DNA 小片段的电洗脱 68

2.9.3 基本方案2 筛分型琼脂糖提肢电掠 69

2.10 DNA 的毛细管电泳 69

2.10.1 基本方案1 寡核苷酸的分离 72

2.10.2 基本方案2 定量PCR 分析 73

2.10.3 备择方案基因型分析 75

2.11 Southern 印迹法 75

2.11.1 基本方案用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southem 印迹 75

2.11.2 辅助方案紫外透射仪的校准 78

2.11.3 备择方案1 用破性缓冲液在尼龙膜上进行Southem 印迹 78

2.11.4 备择方案2 用向下毛细管转移法进行Southem 印迹 79

2.11.5 备择方案3 从聚丙烯酷脑凝肢至尼龙膜的电转印法 79

2.12 DNA 的斑点和狭线印迹 80

2.12.1 基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹 80

2.12.2 备择方案1 用多样抽撞加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA 斑点和狭线印迹 82

2.12.3 备择方案2 DNA 斑点印迹的手工制备 82

2.13 DNA 印迹的杂交分析 82

2.13.1 基本方案制才性标记的DNA 探针对DNA 印迹的杂交分析 84

2.13.2 备择方案用放射性标记的RNA 探针对DNA 印迹进行杂交分析 85

2.13.3 辅助方案从杂交膜上除去探针 87

2.14 寡核苷酸的合成及纯化 89

2.14.1 关于核酸的化学合成洁的介绍 89

2.14.2 核酸合成方案 92

2.14.3 寡核苷酸纯化方案 93

2.15 变性聚丙烯酷胶凝胶电泳纯化寡核苷酸 94

基本方案 94

第3章 DNA 和RNA 的酶学操作 97

3.1 限制性内切核酸酶消化DNA 97

3.1.1 基本方案单酶切消化单个DNA 样品 98

3.1.2 备择方案l 多限制性内切核酸酶消化DNA 99

3.1.3 备择方案2 消化多个DNA 样品 101

3.1.4 备择方案3 限制性内切核酸酶对DNA 部分消化 102

3.1.5 辅助方案DNA 的甲基化 102

3.2 核酸操作的常用试剂和放射性同位素 103

3.2.1 储液溶液 103

3.2.2 10X 酶缓冲液 106

3.2.3 核苷兰磷酸 110

3.2.4 标记核酸的放射性同位素 111

3.2.5 基本方案酸沉淀法测定DNA 和RNA 中的放射性 112

3.2.6 备择方案柱离心法从未掺人的前体dNTP 分离放射性标记DNA 113

3.3 DNA 依赖的DNA 聚合酶 114

3.3.1 基本方案1 缺口翻译标记DNA 114

3.3.2 基本方案2 DNA 的31端标记 115

3.3.3 基本方案3 修复凸出的3或5端以产生平端 116

3.3.4 基本方案4 随机寡核苷酸寻|物介导的DNA 标记 116

3.3.5 天然T7 噬菌体DNA 聚合酶 118

3.3.6 经修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶 118

3.3.7 Taq DNA 聚合酶 119

3.4 不依赖于模板的DNA 聚合酶 119

末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）119

3.5 依赖RNA 的DNA 聚合酶 120

逆转录酶 120

3.6 依艘DNA 的RNA 聚合酶 121

噬菌体的RNA 聚合酶：SP6、T7 和T3 121

3.7 磷酸酶和激酶 122

3.7.1 细菌碱性磷酸酶（BAP） 和小牛肠碱性磷酸酶（CIP） 121

3.7.2 T4 噬菌体多核苷酸激酶 122

3.8 外切核酸酶 122

3.8.1 外切核酸酶VII （ exo VII） 122

3.8.2 噬菌体外切核酸酶（xo） 123

3.8.3 T7 噬菌体基因6 外切核酸酶 123

3.8.4 外切核酸酶III （exo III） 123

3.9 内切核酸酶 124

3.9.1 Bal 31核酸酶 124

3.9.2 Sl核酸酶 124

3.9.3 绿豆核酸酶 125

3.9.4 微球菌核酸酶 125

3.9.5 脱氧核糖核酸酶1 （DNA 酶1） 126

3.9.6 无RNA 酶活性的DNA 酶I 126

3.10 核糖核酸酶 127

3.10.1 核糖核酸酶A （RNA 酶A） 127

3.10.2 元DNA 酶的RNA 酶A 127

3.肌3 核糖核酸酶H （RNA 酶E 127

3.10.4 核糖核酸酶T1 128

3.11 DNA 连接酶 128

3.11.1 T4 幢菌体DNA 连接酶 128

3.11.2 大肠杆菌DNA 连接酶 129

3.12 RNA 连接酶 129

T4 RNA连接酶 129

3.13 DNA 片段的亚克隆 130

3.13.1 基本方案DNA 片段的亚克隆 130

3.13.2 备择方案提肢块中DNA 片段的连接 131

3.14 聚合酶链反应构建重组DNA 132

基本方案DNA 片段亚克隆 132

3.15 非同位素探针的标记和比色检测 132

3.15.1 基本方案1 用切口平移法制备生物素酷化的探针 136

3.15.2 基本方案2 用随机嘉核苦酸引物合成法制备生物素酷化探针 137

3.15.3 辅助方案生物章酷化探针的比包法检测 138

3.15.4 备择方案制备和检测地高辛标记的DNA 探针 139

3.16 非同位素探针的化学发光检测 139

3.16.1 基本方案生物素标记探针的化学发光检测 140

3.16.2 备择方案地高辛标记探针的化学发光捡测 142

3.16.3 辅助方案紫外光源的标准化 142

第4章 RNA 的制备和分析 144

4.1 异硫氨酸脏法制备总RNA 145

4.1.1 基本方案从组织或培养细胞中

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第1章　大肠杆菌、质粒和噬菌体

掌握的DNA操作技术，需要熟悉一些相关的基本概念和实验技巧。本章着重介绍了大肠杆菌以及用于将DNA引入细菌的质粒和噬菌体等载体的生物学特性和操作方法。

大肠杆菌是含有长约3000 kb的环状染色体的棒状细菌。它能在仅含碳水化合物如葡萄糖（提供碳源和能量）和提供氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上快速生长（见1.1～1.3）。然而，如果用含氨基酸、核苷酸前体、维生素以及其他一些细胞不能合成的代谢成分的丰富培养基来培养，那么大肠杆菌的生长会更快。

当大肠杆菌在液体培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个生长滞后期。在丰富培养基中，它能在20～30 min内复制一代，这种指数生长相称之为对数期。后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值。在通常的实验室培养中，这一时相的细胞密度一般为1×109～2×10。细胞／ml，细胞停止迅速分裂。这就是细菌生长的饱和期，而所谓的新鲜饱和即指当培养液中细胞密度刚达到这一水平。

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《精编分子生物学实验指南(第5版)》是知名度很高、不断更新的《最新分子生物学实验方法汇编》系列的精编版本。新版对原有内容进行了修订和更新，包括：大肠杆菌、质粒和噬菌体，DNA的制备和分析，DNA和RNA的酶学操作，RNA的制备和分析，重组DNA文库的构建，重组DNA文库的筛选，DNA序列测定，克隆化DNA的诱变，DNA导人哺乳动物细胞，蛋白质分析，免疫学，DNA-蛋白质相互作用，酿酒酵母，原位杂交和免疫组织化学，聚合酶链反应，蛋白质的表达，蛋白质磷酸化的分析，生物信息学，蛋白质相互作用的分析等；又新增了染色质的装配与分析，核酸阵列，组合文库的建立和使用，单个细胞或一群细胞间差异表达基因的发现和分析四章内容。.